10 Fakten zu Molekularbiologischen Methoden
BLOG: Enkapsis
- Denaturierung: Der erste Schritt besteht aus der Denaturierung des DNA-Doppelstrangs, indem bei 92°C die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst werden.
- Annealing der Primer: Bei einer Temperatur von 50-60°C (sequenzabhängig) lagern sich die Primer an die entsprechende Sequenz der DNA.
- Elongation: Bei einer Temperatur von ca. 72°C findet eine Neusynthese des Doppelstrangs mittels der DNA-Polymerase statt. Die Verlängerung beginnt dabei am 3´-Ende des Primers.
Diese Reaktionen werden zyklisch wiederholt, wobei eine exponentielle Amplifikation der DNA erzielt wird. So können z.B. nach 30 Zyklen bis zu eine Milliarde DNA-Kopien vorliegen.
Die Elektrophorese ist eine analytische Methode zur Auftrennung von DNA- und RNA-Fragmenten, die mittels eines elektrischen Feldes in einem Gel wandern, das aus Agarose-Polymeren besteht, die zu einem Gel vernetzt sind und als eine Art Sieb mit Poren funktionieren. Größe und Ladung der Moleküle beeinflussen deren Wandergeschwindigkeit, wobei kleinere Fragmente z.B. schneller wandern als Größere. Die Wanderungsgeschwindigkeit von linearen DNA-Molekülen ist dabei umgekehrt proportional dem dekadischen Logarithmus der Anzahl der Basenpaare. Erwähnt sei noch, dass beim Wandern der Moleküle das Gel in einem Elektrophoresepuffer liegt. Mit Hilfe von Beladungspuffern, die der aufzutrennenden DNA zugesetzt werden, lassen sich das Auftragen der Proben besser visualisieren und das Fortschreiten der Auftrennung überwachen. Das Sichtbarmachen der DNA erfolgt durch Verwendung von Ethidiumbromid, dass dem Gel vorher zugesetzt wurde. Dieser Farbstoff lagert sich an die DNA und kann durch UV-Licht mit einer Wellenlänge von 300nm zum Fluoreszieren gebracht werden.
3.) Plasmide
Plasmide sind zirkuläre DNA-Moleküle, die in Bakterien vorkommen und meistens Antibiotika-Resistenzen und andere charakteristische Gene aufweisen. In der Molekularbiologie werden solche Vektoren für Klonierungen verwendet. Dies bedeutet, der Vektor wird dabei „aufgeschnitten“ und die gewünschte DNA „hereingeklebt.“ Die Plasmide werden dann in Bakterien eingebracht, die es vervielfältigen. Folgende drei Strukturelemente sind in allen Plasmiden zu finden:
- Replikationsursprung: Zur Vermehrung des Plasmids in Bakterienkolonien
- Resistenzgen: Zur Selektion positiv transformierter Bakterienkolonien
- Multiple cloning site (MCS): Einbau der gewünschten DNA
Bei der Extraktion wird Phenol als Wasserstoffbrückenbildner eingesetzt, wodurch die Protein-Nukleinsäure-Komplexe in die einzelnen Bestandteile dissoziieren, indem es Wechselwirkungen mit den Aminosäureketten eingeht. Die Proteine werden so denaturiert und reichern sich in der Phenolphase an. Gleichzeitig dient Chloroform der Phasentrennung und der Denaturierung von Proteinen, so dass die Nukleinsäuren rein vorliegen. Die DNA kann dann mittels Ethanol oder Isopropanol gefällt werden.
Diese Methode dient der Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien. „Mini“ bedeutet dabei, dass nur geringe Mengen isoliert werden. Sogenannte Maxipräparationen dienen der Extraktion von größeren Mengen. Die Bakterien werden bei dieser Methode zu einem Pellet zentrifugiert und mit verschiedenen Puffern behandelt, so dass sie lysiert werden. EDTA verhindert die Degradation der DNA und SDS das Lösen von Proteinen. Kaliumacetat präzipitiert das SDS, wodurch am Ende nur noch die DNA übrig ist.
6.) Restriktionsverdau
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA innerhalb einer palindromen Sequenz schneiden können und der Kartierung von DNA dienen. Sie kommen ursprünglich in Bakterien vor und schützen dort den Wirt vor fremden Partikeln, die gespalten und zerstört werden. Die eigene DNA wird dabei durch Methylierung geschützt. Der Name der Enzyme leitet sich vom Vorkommen in den jeweiligen Bakterien ab. Restriktionsenzyme unterliegen einer spezifischen Aktivität bei der sie unter optimalen Bedingungen funktionieren können. Die Reinheit der DNA sollte dabei möglichst hoch und der Salzgehalt der Lösung möglichst klein sein. Zudem optimieren Reaktionspuffer das Ergebnis. Wegen ihre Temperaturlabilität sollten die Enzyme möglichst bei -20°C gehalten werden.
7.) Klonierung
Unter Klonierung versteht man das Einbringen von DNA in einen Vektor. Der Vektor wird in seiner multiple cloning site mit dem gewünschten Enzym aufgeschnitten und die DNA "hineingelebt". Später wird der Plasmid in kompetente Bakterien transfomiert und die DNA vervielfältigt. Nach dem Verdau können drei Arten von Überhängen entstehen:
- 3´-Überhang (Sticky-End)
- Stumpfe Enden
- 5´-Überhang (Sticky-End)
Bei der Ligation mit der Wunsch-DNA muss darauf geachtet werden, welche von den drei Möglichkeiten gewählt wird, um eine optimale "Verklebung" zu erreichen.
Hierbei handelt es sich um das Zusammenlagern von einzelsträngiger DNA oder RNA mittels komplementären Nukleotidsequenzen unter Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist z.B. eine Methode bei der aus Nukleinsäuren künstlich hergestellte Sonden, die zu einem gesuchten Gen komplementär ist, an das gewünschte Gen hybridisieren und durch Markierung nachgewiesen werden kann. Eine solche Markierung besteht z.B. aus radioaktiven Substanzen wie ³²P oder nicht-radioaktiver Substanzen wie Digoxigenin (DIG). DIG ist ist ein Steroid-Hapten, wird als Konjugat mit dUTP eingebaut und kann mittels eines monoklonalen Antikörpers nachgewiesen werden.
10.) DNA-Sequenzierung
Mit der DNA-Sequenzierung kann man die Nukleotidabfolge von unbekannter oder gewünschter einzelsträngiger DNA bestimmen. Die template-DNA wird dabei mit einem Primer versehen, der nur zu einer Stelle der DNA komplementär ist an dem dann die ausgehend vom 3´-Ende die Synthese des komplementären Strandes mittels der T7-DNA-Polymerase stattfindet. Heutzutage greift man dabei auf die Methode der PCR zurück. Dabei findet die Sequenzierreaktion in einem Gefäß mit allen vier unterschiedlich markierten ddNTP´s statt, die dann mittels Laseranregung detektiert werden können.
Wessel-Flügge-Methode
“Die DNA kann dann mittels Ethanol oder Isopropanol gefällt werden. Als Fällung wird z.B. die Wessel-Flügge-Methode benutzt.”
Von der Wessel-Flügge-Methode hab ich noch nie was gehört…kurzes Googlen hat ergeben, dass diese Methode anscheinend aber weniger zur Aufreinigung von DNA, sondern zur Konzentration von recht dünnen Proteinlösungen verwendet wird. Zumindest war das die Art der Verwendung von zwei Leuten, die in Bioforen nach Rat fragten, nachdem die Methode bei Ihnen nicht funktionierte 😉
Wozu also ist diese Fällung bei der DNA-Extraktion nötig? Nur um die Proteine zu denaturieren? Das erledigt ja schon das Phenol, oder?
Gruß Stefan
@Stefan
Hey Stefan,
Ja klar, das übernimmt das Phenol. Die weitere Anwendung der Wessel-Flügge-Methode ist hier natürlich nicht angebracht! Ich habe mich in diesem Paragraphen ein bischen ungeschickt ausgedrückt und muss das gleich noch korrigieren. Ich meinte natürlich, dass man als DNA-Extraktion die Wessel-Flügge-Method eim Allgemeinen anwenden kann, da man damit eben die Proteine aus der Lösung “rausschmeißen” kann und somit nur noch reine DNA hat. Andererseits muss man nicht unbedingt die Wessel-Flügge-Methode anwenden, sondern kann auch die beschriebene Phenol-Extraktion und anschließende Ethanol-Fällung durchführen.
@Sebastion
Hi Sebastian!
Irgendwie bin ich immer noch nicht richtig glücklich 😉
“Die DNA kann dann mittels Ethanol oder Isopropanol gefällt werden. Als Fällung der DNA wird z.B. die Wessel-Flügge-Methode benutzt, …”
Ich denke, die Reihenfolge, in der Du die Schritte erwähnst, ist unglücklich, oder ich hab was nicht verstanden. Bevor man die DNA fällt, hat man die Proteine ja bereits abgetrennt. DANACH Wessel-Flügge anzuwenden, erscheint mir unnötig, da Wessel-Flügge Proteine präzipitiert bzw. gefällt werden. Das finde ich oben auch merkwürdig formuliert, da eben Proteine und nicht DNA gefällt wird. Oder hab ich das falsch verstanden?
Gruß Stefan 🙂
Genau! Ich erwähne die Wessel-Flügge-Methode nur, da man mit ihr aus einem Protein-DNA-Gemisch die Proteine präzipitierne kann und somit auch reine DNA übrig bliebt. Mit der Phenol-Ethanol-Extraktion, die die DNA präzipitiert hat dies rein garnichts zu tun. Wie du schon sagst, ich habe es unglücklich formuliert und da die letzte Umformulierung auch noch unklar ist…ändere ich es noch einmal.
So find ich’s jetzt sehr gut formuliert und nachvollziehbar 🙂
Stefan