Mit Morpholinos gegen Resistenzen – mal was Neues ohne CRISPR/Cas9

Mich plagen immer mal wieder Halsschmerzen. Der Mann empfiehlt mir dann immer den vermuteten Bakterien mit dem Gurgeln von Salzwasser den Gar aus zu machen. Ob es was hilft – man weiß es nicht. Eklig genug ist es jedenfalls. Mein Hausarzt ist zum Glück auch konservativ, was das Verschreiben von Antibiotika angeht. Mittlerweile sollte es sich ja herumgesprochen haben, dass bei gefühlter Grippe Antibiotika nicht automatisch die Mittel der Wahl sind. Außer Nebenwirkungen ist da immer die Gefahr von Resistenzbildung bei den kleinen Biestern. Multiresistente Keime und so. An einigen Stellen wird bereits davor gewarnt, dass wir auf dem besten Weg sind in die prä-Antibiotika-Ära zurückzufallen.

Vor einer Weile hatte ich schon mal berichtet, wie im Boden rumgewühlt wird um neue Antibiotika zu finden. Auch nicht schlecht ist der Ansatz, den ich euch heute vorstelle. Eine Gruppe aus den USA berichtete im letzten Monat wie sie Morpholinos nutzen um die Anfälligkeit von Bakterien gegenüber verschiedenen Antibiotika zu erhöhen. Bakterien nutzen verschiedene Mechanismen um Resistenzen gegen Antibiotika zu erzeugen (ich komme gleich auf Morpholinos zurück). Dabei stehen nicht unbedingt eingebrachte Mutationen der Zielenzyme im Vordergrund, wobei das natürlich auch vorkommt (vor allem bei Vancomycin). Antibiotika greifen meist an wichtigen Stoffwechselwegen der Bakterien an, wo Mutationen auch einen nachteiligen Effekt für die Bakterie haben können. Ein wichtiger Mechanismus der Antibiotikaresistenz besteht im Entfernen des Stoffes durch Efflux-Pumpen, also Kanäle in der Zellwand der Bakterien, die Moleküle wieder nach draußen befördern. Die Idee ist, dass ein Ausschalten dieser Efflux-Pumpen in Bakterien die Anfälligkeit gegenüber Antibiotika erhöht. Jetzt könnte man mit Hilfe von genetic engineering die entsprechenden Gensequenzen einfach kaputt machen und gut ist. So schön diese neuen Tools auch sind, ihre klinische Anwendung steckt noch in den allerkleinsten Kinderschuhen. Einen Patienten mit einem multiresistenten Keim derart zu behandeln, ist derzeit keine Option. Aber auch ohne CRISPR/Cas9 und dergleichen es gibt ja durchaus andere Möglichkeiten Gene zum Schweigen zu bringen, wobei wir wieder bei den Morpholinos wären. Dabei handelt es sich um synthetische Nukleinsäure-Analoga. Das Rückgrat bilden dabei kein Desoxyribosephosphate, sondern Morpholine (6er-Ring mit Ethergruppe und sekundärem Amin), die über Phosphordiamidat verknüpft sind. Jeder Morpholinring trägt eine der bekannten Basen unserer DNA, ATGC. Das wird dann Morpholino genannt. Die resultierenden Moleküle sind der DNA recht ähnlich. So ähnlich, dass Morpholinos in der Lage sind komplementäre mRNA zu binden. An der passenden Stelle platziert sind Morpholinos durch sterische Behinderung in der Lage die Übersetzung von Genen in ihre Proteine zu verhindern. Jetzt könnte man natürlich für den gleichen Zweck auch siRNAs verwenden, die ebenfalls an mRNA binden, diese dann aber abbauen. Der Vorteil von Morpholinos liegt in deren deutlich höheren Stabilität, über mehrere Tage hinweg, und vor allem Spezifität und dadurch geringen Toxizität.

Morpholino-Struktur

Wie bereits erwähnt, spielen Efflux-Pumpen eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Antibiotikaresistenzen. Die vorgestellte Gruppe fokussierte sich daher auf in E.coli vorkommende Membranproteine. Zunächst wurden dazu fünf gängige Gene aus dem E.coli-Genom entfernt und zwar in allen 32 möglichen Kombinationen. In der Abbildung oben links: Resistenzgen drin – schnipp – Resistenzgen draußen. Eine äußerst eingängige Darstellung des experimentellen Designs. Anschließend wurde die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von verschiedenen Antibiotika getestet, also die Konzentration bei der Bakterien anfangen zu sterben. In der Abbildung oben rechts sieht man wie nach entfernen der genannten Gene (dargestellt durch das Delta-Symbol) bei zunehmender Clindamycin-Konzentration die optische Dichte (OD) abnimmt. Da Bakterien in Wasser eine Suspension und keine Lösung bilden, schwächen sie durch Absorption, Streuung etc. einfallendes Licht ganz gewaltig. Auf schlau heißt das Reduktion der optischen Dichte und bedeutet nichts anderes, als dass die Bakterien sterben. Dabei fiel auf, dass das Entfernen des Gens acrB in allen Kombinationen die MIC deutlich senkte, die Bakterien also viel anfälliger für Antibiotika wurden. Bei den anderen untersuchten Genen war dies nicht der Fall. In der Abbildung unten ist dazu eine sogenannte Heatmap gezeigt. Je dunkler die Farbe desto größer der Effekt. In allen Kombinationen mit AcrB ist es ziemlich dunkel. Die Autoren schlussfolgern daraus, dass acrB zur intrinsischen Antibiotikaresistenz von E.coli beiträgt und dass die anderen Gene zu einer erworbenen Antibiotikaresistenz beitragen können, nämlich wenn diese entsprechend mutieren. Das macht auch Sinn, da acrB ein Protein bildet, das Teil der Efflux-Pumpe AcrAB-TolC ist. Für die weiteren Experimente wurde dann auch das Gen acrA verwendet, aus dem simplen Grund, dass die entworfenen acrA-Morpholinos am besten funktionierten. Die Anwendung von diesen Morpholinos auf Wildtyp-Bakterien konnte dann die Sensitivität gegen das Antibiotikum Clindamycin, das normalerweise auf Grund seines hohen MICs nicht bei E.coli-Infektionen angewandt wird. Das komplette Entfernen des Gens aus dem vorangegangenen Experiment war allerdings noch erfolgreicher. Eine Ausweitung des Experiments mit weiteren Antibiotika zeigte, dass der Effekt dabei sehr unterschiedlich ausfiel.

Auswirkung des Entfernens von verschiedenen Membranproteinen aus E.coli auf die Wirkung von Antibiotika. a: Experimentelles Design; b: Auswirkung der verschiedenen Proteindeletionen auf die Optische Dichte der Bakteriensuspension; c: Heatmap der Kombinationen des Einflusses der verschiedenen Proteinkombinationen auf die Antibiotikawirkung

Credit: PLOS Biology: 2016 Ayhan et al., doi:10.1371/journal.pbio.1002552 CC BY 4.0 Auswirkung des Entfernens von verschiedenen Membranproteinen aus E.coli auf die Wirkung von Antibiotika. a: Experimentelles Design; b: Auswirkung der verschiedenen Proteindeletionen auf die Optische Dichte der Bakteriensuspension; c: Heatmap der Kombinationen des Einflusses der verschiedenen Proteinkombinationen auf die Antibiotikawirkung

Für eine Publikation reichen diese Ergebnisse schon lange nicht mehr. Also wurden die Ergebnisse auf verschiedene Arten verifiziert. Zunächst wurde geprüft, wie spezifisch der Effekt auf acrA tatsächlich ist. Dazu wurden verschiedene Bakterien mit den Morpholinos behandelt. Je ähnlicher die DNA-Sequenzen denen von E.coli waren, desto stärker war die Wirkung des Morpholinos: ein Punkt für die Spezifität des acrA-Morpholinos. Dann wurde der Proteingehalt von acrA gemessen: deutliche Verringerung in Anwesenheit des Morpholinos. Labormenschen mögen aber nicht nur Balkendiagramme, sondern vor allem bunte Bilder. Leider machen uns die Autoren nicht den Gefallen, sondern haben daraus einfach auch ein Diagramm gebastelt. Da wollten sie den ganzen Spaß den sie hatten nicht mit uns teilen. Wie dem auch sei, die Zellen wurden jedenfalls mit dem Farbstoff Hoechst 33342 gefärbt. Dieser wird von den Zellen entlang des Konzentrationsgradienten aufgenommen. Um aus der Zelle wieder rauszukommen bedarf es allerdings besagter Efflux-Pumpe. Und siehe da, bei Anwesenheit des Morpholinos blieben die Zellen angefärbt. Übertragen auf die Antibiotika bedeutet das, dass das acrA-Morpholino dafür sorgt, dass die Antibiotika von den Bakterien nicht wieder rausgeschmissen werden kann und seinen zerstörerische Wirkung voll entfalten kann.

Um dem Ganzen dann auch noch klinische Relevanz zu verleihen wurde das acrA-Morpholino dann in Kombination mit verschiedenen in der Klinik angewandten Antibiotikakombinationen verwendet. Die Forscher konnten dabei zeigen, dass die Sensitivität von sowohl synergistischen als auch antagonistischen Antibiotikakombinationen durch das acrA-Morpholino erhöht wurden. Das ist insofern interessant, als das synergistische Kombinationen besonders dazu neigen die Entwicklung von Multiresistenzen zu unterstützen und antagonistische Kombinationen schwierig sind weil sie, nun ja, antagonistisch wirken. Um auch noch die letzten Zweifler zu beruhigen, wurde schließlich noch bestätigt, dass das Morpholino keinen toxischen Effekt auf humane Lungenzellen hat (liest sich für mich wie die Antwort auf die Forderung eines Reviewers 🙂 ).

Wenn ich das nächste Mal bei meinem Hausarzt bin, kann ich ihm ja ein paar Microgramm der Morpholinos mitbringen. Vielleicht verschreibt er mir im Namen der Forschung ja Antibiotika für einen freiwilligen Feldversuch.

Claudia Davenport hat in Potsdam und Hannover Biochemie studiert und promoviert mittlerweile über Insulin-produziernende Surrogatzellen aus embryonalen Stammzellen zur Behandlung des Diabetes Typ 1. Wenn sie gerade mal nicht im Labor am Durchbruch arbeitet, der die Welt verändern wird, ist sie gerne im Grünen, radelt durch die Gegend oder geht Kaffee trinken.

3 Kommentare Schreibe einen Kommentar

  1. Ob das Gurgeln mit Salzwasser die Bakterien tötet, naja. Jedenfalls werden die Halsschmerzen deutlich weniger (eigene Erfahrung), evtl. werden ja nur die Nervenenden „gezähmt“. Egal, hauptsache man kann wieder schlucken.
    Zurück zum Thema: Interessante Methode, das bestätigt wieder mal, dass Kombipräparate, wenn sinnvoll zusammengestellt, durchaus unser Waffenarsenal gegen Bakterien noch eine Zeit lang erhalten können.

  2. Claudia Davenport schrieb (6. Oktober 2016):
    > Morpholinos […] Dabei handelt es sich um synthetische Nukleinsäure-Analoga.
    > dass Morpholinos in der Lage sind komplementäre mRNA zu binden. An der passenden Stelle platziert sind Morpholinos durch sterische Behinderung in der Lage die Übersetzung von Genen in ihre Proteine zu verhindern. Jetzt könnte man natürlich für den gleichen Zweck auch siRNAs verwenden, die ebenfalls an mRNA binden, diese dann aber abbauen. Der Vorteil von Morpholinos liegt in deren deutlich höheren Stabilität, über mehrere Tage hinweg, und vor allem Spezifität […]

    Wie erklärt sich die „[deutlich höhere] Spezifität von Morpholinos im Vergleich zu smRNA von (vermeintlich) der selben Basensequenz?

    (Ach so – sind die Morpholinos vielleicht etwas länger?) ..

    • So ist es, die Länge machts. Morpholinos sind i.d.R. 25 bp lang. Das sollte bei siRNA zwar im Idealfall auch der Fall sein, in der Realität (zumindest in meiner Erfahrung) sind es aber meist weniger als 20 bp, was dann schneller zu Off-Target Effekten führen kann. Der eigentliche Vorteil gegenüber siRNA ist aber die deutlich höhere Stabilität, da Morpholinos nicht von Nukleasen abgebaut werden. Der entschiedene Nachteil ist auf der anderen Seite, dass es bisher nur eine einzige Firma gibt, bei denen man die Dinger synthetisieren lassen kann. Das dürfte dann teilweise auch die vergleichsweise geringere Verbreitung der Morpholinos erklären.

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